聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定IgG纯度操作方法


聚丙烯酰胺生产车间


印染业污水聚丙烯酰胺实验效果

1.安装夹心式垂直板电泳槽

夹心式垂直板电泳槽操作简单,不易渗漏。这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽,两个电极槽中间夹有一个凝胶模,该模由一个上框形凝胶框、长与短玻璃板及样品槽模板(梳子)所组成。电泳槽由上储槽(白金电极在上或面对短玻璃板),下储槽(白金电极在下或面对长玻璃板)和回纹状冷凝管组成。两个电极槽与凝胶模间靠储液槽螺丝固定。各部间依下列顺序组装:

(1)将上储槽和固定螺丝销钉,仰放在桌面上。

(2)将上、短玻璃板分别插到上框形硅橡胶的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。

(3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上储槽上,短玻璃板应面对上储槽。

(4)将下储槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上储槽,双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。

(5)竖直电泳槽,在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙,凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。

2.配胶

① 分离胶 20ml pH8.9 7.0%PAA溶液中,凝胶缓冲液(pH8.9)2.5ml,分离胶贮液5.0ml,重蒸馏水2.5ml,充分混匀,抽气10min,最后加AP 10 ml。

② 浓缩胶 pH6.7 25% PAA:浓缩胶缓冲液∶浓缩胶贮液∶40%蔗糖溶液∶核黄素溶液按1∶2∶4∶1的比例混合。

3.制备凝胶板

不连续体系采用不同孔径及pH的分离胶与浓缩胶 ,凝胶制备应分2步进行。

① 分离胶的制备:根据实验要求,选择最终丙烯酰胺的浓度,本实验需20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液,其加胶方式不同于连续系统。混合后的凝胶溶液,用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内,加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用1cm注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约3-4mm)用于隔绝空气,使胶面平整。为防止渗漏,在上、下储槽中加入略低于胶面的蒸馏水。约30-60min凝胶完全聚合,则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。用滤纸条吸去多余的水,但不要碰破胶面。如需预电泳,则上、下储槽的蒸馏水倒去,换上分离胶缓冲液,10mA电流电泳1h,终止电泳后,弃去分离胶缓冲液,用注射器取浓缩胶缓冲液洗涤胶面数次,即可制备浓缩胶。

② 浓缩胶制备:浓缩胶为pH6.7 25%PAA,混合均匀后用细长的滴管将凝胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方),距短玻璃板上缘0.5cm处,轻轻加入样品槽模板。在上、下储槽中加入蒸馏水,但不能超过短玻璃板上缘。在距离电极槽10cm处,用日光灯或太阳照射,进行光聚合,但不要造成大的生温。在正常情况下,照射6-7min,则凝胶由蛋黄透明变成乳白色,表明聚合作用开始。继续光照30min,使凝胶聚合完全。光聚和完成后放置30-60min,轻轻取出样品槽模板,用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的液体,加入稀释10倍pH8.3的Tris-甘氨酸电极缓冲液。使液面没过玻璃板约0.5cm,即可加样。

4.加样

作为分析用的PAGE加样量仅需几微克,2-3ul血清电泳后就能分出几十条蛋白区带。为防止样品扩散,应在样品中加入等体积40%蔗糖(内含少许溴酚兰)。用微量注射器取5ul上述混合液,通过缓冲液,小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部,待所有凹形样品槽内都加了样品,即可开始电泳。

5.电泳

将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接,负极与上槽连接(方向切勿接错)。接通冷却水,打开电泳仪开关,开始时将电流调至10 mA 。待样品进入分离胶时将电流调至20-30mA。当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘1cm时,将电流调回到零,关电源及冷却水。分别收集上、下贮槽电极缓冲液置试剂瓶中,4℃贮存还可用1-2次。旋松固定螺丝,取出硅橡胶框,用不锈钢铲轻轻将一块玻璃板撬开移去,在胶板一端切除一角作为标记,将胶板移至大培养皿中染色。

6.固定,染色

本实验采用0.05%考马斯亮蓝R250(内含20%磺基水杨酸)染色液,染色与固定同时进行,使染色液没过胶板,染色30min左右。

7.脱色

用7%乙酸侵泡漂洗数次,直至背景蓝色褪去。如用50℃水浴或褪色摇床,则可缩短褪色时间。脱色液经活性碳脱色后,可反复使用。

(四)注意事项

1.制备凝胶应选用高纯度得试剂,否则会影响凝胶聚合与电泳效果。Acr及Bis是制备凝胶得关键试剂,如含有丙烯酸或其它杂质,则造成凝胶聚合时间延长,聚合不均匀或不聚合,应将它们分别纯化后方能使用。Acr及Bis均为神经毒剂,对皮肤有刺激作用,实验表明对小鼠得半致死量为170mg/kg,操作应在通风中进行。Acr的纯化:称70gArc溶于1000ml 50℃预热的氯仿中,溶解后趁热过滤。冷却后,置-20℃低温冰箱中,则有白色结晶析出,用预冷的布氏漏斗抽滤,收集白色结晶,再用预冷的氯仿淋洗几次,真空干燥后置棕色瓶中密封储存。Acr的熔点为84.5+0.3。纯Acr水溶液pH应是,其pH值变化不大于0.4pH单位就能使用。Bis的纯化:称12gBis,使其溶于1000ml预热40-50℃的丙酮中,趁热过滤。冷却后,置-20℃低温冰箱中,待结晶析出后,用预冷的布氏漏斗抽滤,收集结晶,用预冷丙酮洗涤数次,真空干燥后置棕色瓶阿訇密封保存,Bis熔点为185℃。Acr和Bis的储液在保存过程中,由于水解作用而形成丙烯酸和NH3,虽然溶液放在棕色试剂瓶中,4℃储存能部分防止水解,但也只能储存1-2个月,可测pH值(4.9-5.2)来检查试剂是否失效。

2.由于与凝胶聚合有关的硅橡胶条、玻璃板表面不光滑洁净,在电泳时会造成凝胶板与玻璃或硅橡胶条剥离,产生气泡或滑胶;剥交时凝胶板易断裂,为防止次现象,所以器材应严格地清洗。硅橡胶条的凹槽、样品槽模板及电泳槽用泡抹海绵蘸取“洗洁净”仔细清洗。玻璃板侵泡在重铬酸钾洗液3-4h或0.2mol/LKOH的酒精溶液中20min以上,用清水洗净,再用泡沫海绵蘸取“洗洁净”反复刷洗,最后用蒸馏水冲洗,直接阴干或用乙醇冲洗后阴干。

3.安装电泳槽和镶有长、短玻璃的硅橡胶框时,位置要端正,均匀用力旋转紧固定螺丝,以免缓冲液渗漏。样品槽模板梳齿应平整光滑。

4.用琼脂(糖)封底及灌凝胶时不能有气泡,以免影响电泳时电流的通过。

5.凝胶完全聚合后,必须放置30min-1h,使其充分“老化”后,才能轻轻取出样品槽模板,切勿破坏加样凹槽底部的平整,以免电泳区带扭曲。

6.为防止电泳后区带拖尾,样品中盐离子强度应尽量低,含盐量高的样品槽可用透析法或凝胶过滤法脱盐。最大加样量不得超过100ug蛋白/100ul。

7.在不连续电泳体系中,预电泳只能在分离胶聚合后进行,洗净胶面后才能制备脓缩胶。浓缩胶制备后,不能进行预电泳,以充分利用浓缩胶的浓缩效应。

8.电泳时,电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错,以免样品反方向泳动,电泳时应选用合适的电流、电压、过高或过低均可影响电泳效果。

9.电泳后,应分别收集上下储槽电极缓冲液,在冰箱储存,可用2-3次。为保证电泳结果满意,最好用新稀释的缓冲液。

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